Comment visualiser les molécules d’ARN in vivo

Le transport et la localisation des ARN messager (ARNm) après leur synthèse sont des mécanismes importants pour déterminer la localisation subcellulaire de la traduction des protéines. En dictant la localisation spécifique où les protéines sont traduites et fonctionnent, les processus de localisation de l'ARN jouent un rôle central dans la détermination de la polarité cellulaire, la structuration embryonnaire, les décisions asymétriques sur le devenir des cellules, la morphogenèse neuronale, la migration cellulaire ou la polarité épithéliale.

Il est admis que les ARNm sont transportés sous forme de complexes de ribonucléoprotéines (RNP) ou de «granules d'ARN». Ces granules sont transportés par des moteurs moléculaires le long du cytosquelette jusqu'à leur destination finale, où les ARNm sont ancrés et finalement traduits. L'analyse des mécanismes de transport d'ARN chez les plantes repose sur des méthodes d'imagerie efficaces pour suivre les molécules d'ARN transportées in vivo.

Dans le cadre d'une collaboration avec l'Université de La Plata (Argentine), les scientifiques ont développé une nouvelle méthode pour observer la dynamique des mouvements et localisations de molécules d'ARN messager dans les cellules végétales. Cette méthode utilise BglG, une protéine bactérienne anti-terminateur de la transcription qui se lie à un motif de structure tige-boucle spécifique dans l'ARN cible. Ainsi, les molécules d'ARN marquées avec ce motif tige-boucle peuvent être visualisées en présence de BglG fusionnée avec un marqueur fluorescent.

Les chercheurs ont utilisé un ARNm codant pour la protéine de mouvement (MP) du virus de la mosaïque du tabac (VMT) comme modèle. La MP est une protéine de liaison à l'ARN qui est nécessaire à la propagation du virus de cellule à cellule. Pour remplir cette fonction, la protéine forme un complexe avec l'ARN viral et utilise des mécanismes de transport cellulaire pour cibler l'ARN viral vers de petits pores de la paroi cellulaire végétale appelés plasmodesmes par lesquels il pénètre dans de nouvelles cellules. Les chercheurs ont utilisé une méthode appelée agroinfiltration pour exprimer la MP fusionnée à la protéine fluorescente verte (MP:GFP) dans des cellules de feuilles de Nicotiana benthamiana. Par microscopie confocale à fluorescence, la protéine est ainsi visualisée sous la forme de petites particules fluorescentes soit stationnaires, soit mobiles, dans la région corticale des cellules épidermiques.

Pour déterminer si ces particules contiennent l'ARNm codant pour MP:GFP, on a ajouté à ce dernier des séquences d'ARN formant des structures tige-boucle spécifiques qui se lient à la protéine BglG. Lorsque cette construction est exprimée avec la protéine BglG fusionnée à la protéine fluorescente rouge (BglG:RFP), les particules MP:GFP (vertes) se révélent associées à BglG (rouge), identifiant ainsi les particules sous forme de granules d'ARN. Cette association n'est pas retrouvée lorsque MP:GFP est exprimé à partir d'une construction sans les boucles de tige de liaison BglG.

Les chercheurs ont également montré que l'ARNm colocalise avec MP:GFP dans les plasmodesmes et que BglG:RFP était même transportée dans les cellules adjacentes, reliant ainsi l'observation des granules d'ARNm avec le transport intercellulaire de l'ARNm.

Des expériences biochimiques confirment que ce complexe MP:ARN:BglG se forme en présence des tige-boucles se liant à BglG.

Enfin, les auteurs ont comparé le système BglG avec d'autres systèmes de marquage d'ARNm. Contrairement aux protéines de liaison à l'ARN utilisées dans d'autres systèmes de marquage d'ARNm (appelées «MS2» et «λN»), la protéine BglG n'a pas tendance à former des agrégats dans les cellules végétales lorsqu'elle est présente en quantité élevée, ce qui est très important pour la détection spécifique des granules d'ARN. Le système BglG peut donc être largement applicable pour étudier le transport et la localisation de l'ARNm dans les plantes.

Pour en savoir plus :

In vivo imaging of tagged mRNA in plant tissues using the bacterial transcriptional antiterminator BglG.
Peña EJ, Robles Luna G, and Heinlein M
The Plant J, 24 Oct 2020  https://doi.org/10.1111/tpj.15035